Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細胞增殖與活性檢測試劑盒是百螢生物生產的一種基于 WST-8 的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。其主要成分為水溶性四唑鹽 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，WST-8 是一種類似于 MTT 的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜（formazan)。WST-8 被細胞內脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠直接溶解在培養基中。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺;顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供最優質的熒光探針。

• CCK-8 細胞增殖與活性檢測的專家
• CCK-8 常見問題詳解

產品特點

本試劑盒提供了一種靈敏度高，操作簡便，使用安全的細胞增殖與活性檢測方法。與傳統的 MTT 實驗相比具有明顯的優勢：

1.MTT實驗生成的甲臜不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有機溶劑溶解；而本方法產生的甲臜是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

2.與 MTT 方法相比，本方法線性范圍更寬，靈敏度更高。

3.本方法對細胞無毒性，可以多次測定，選取最佳測定時間。

4.本方法所用試劑在培養基中比 MTT 更加穩定，實驗結果重復性好。

5.MTT 具有毒性，同時其生成的甲臜需要有機溶劑溶解，會對操作人員身體造成危害。本試劑無毒，使用中無需有機溶劑，操作更加安全。

6.本試劑盒在-20°C 避光可長期保存，使用無需配制，即開即用。

本試劑盒可以用于生物活性因子的活性檢測，抗腫瘤藥物的篩選，細胞增殖的測定，細胞毒性檢測以及藥敏等與細胞活性和增殖相關的實驗。本試劑盒使用方便，試劑盒包含一管已經配制好的含有 WST-8 的 CCK-8 溶液，即開即用，無需其他準備步驟。檢測過程也無需采用額外的步驟去溶解甲臜，可直接使用 96 孔板或者 384 孔板在酶標儀上檢測，適合大規模，高通量的樣品檢測。

實驗方案

1.在96 孔板中配置100μL的細胞懸液（通常細胞增殖實驗每孔加入100μL2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100μL5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定)。按照實驗需要，進行培養（在37°C，5%CO2的條件下）預培養24 小時。

2.向培養板加入1-10μL 不同濃度的待測藥物刺激。

3.將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24 或48 小時）。

4.每孔加入10μLCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數）。如果起始的培養體積為200μL，則需加入20μLCCK-8溶液，其它情況以此類推。可以用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。如果擔心所使用的藥物會干擾檢測，需設置加了相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。

5.在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時，對于大多數情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗。

6.用酶標儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

7.如果暫時不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK 之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

注意事項：

1.由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。

2.CCK-8檢測細胞活性的原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設法去除。

3.建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。

4.建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK 試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要插到培養基液面下加樣，容易產生氣泡，會干擾OD 值讀數。

5.當使用標準96 孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL培養基)，且培養時間長一些。如果要使用24 孔板或6 孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6.加入CCK -8溶液時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色已變化或pH值變化。建議換用新鮮的培養基。

7.如果沒有450nm 的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

8.酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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試劑應用文獻