Cell Meter 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒，Cell Meter檢測(cè)試劑盒是一類用于檢測(cè)細(xì)胞功能的系列工具，包括細(xì)胞活性、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞膜電位以及細(xì)胞周期等方面的指標(biāo)。每種檢測(cè)方案均能提供不同熒光顏色的檢測(cè)方案。這些檢測(cè)方案為從多角度研究細(xì)胞功能活動(dòng)提供了一種十分有效的方法。Cell Meter細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒 *綠色/紅色雙重?zé)晒? 使用兩種非熒光性指示劑：Calcein AM，用于活細(xì)胞；一種非細(xì)胞滲透性的DNA結(jié)合染料，用于細(xì)胞膜不完整的死細(xì)胞。Calcein AM是一種疏水性復(fù)合物，可以輕易地滲透進(jìn)入完整的活細(xì)胞，通過(guò)酯酶的水解作用，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酯酶水解非熒光性Calcein AM，形成具有強(qiáng)烈熒光的親水性Calcein，并且保留在細(xì)胞質(zhì)中。這種酯酶的活性與活細(xì)胞數(shù)量成比例關(guān)系。DNA結(jié)合染料極性非常大，不能滲透進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞，它只有在與死細(xì)胞的DNA結(jié)合的情況下才發(fā)出熒光。生長(zhǎng)在培養(yǎng)板中的細(xì)胞可以被染料，且在不到兩小時(shí)內(nèi)就可以完成定量分析。本檢測(cè)法比其它活細(xì)胞檢測(cè)法更加強(qiáng)大、穩(wěn)定。它可以用于許多熒光實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的高通量分析中，例如微孔板分析，免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)。本試劑盒提供所有必需組分檢測(cè)方案。它適合于增殖型和非增殖型細(xì)胞，也可用于懸浮和貼壁細(xì)胞。96微孔板中，每孔用試劑100ul，本試劑盒提供的試劑足以進(jìn)行100次檢測(cè)；384微孔板中，每孔加試劑25ul，本試劑盒提供的試劑足以進(jìn)行400次檢測(cè)。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Cell Meter 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒。 

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流式細(xì)胞儀
Ex:	488 nm
Em：	530/30 nm、610/20 nm
通道:	FITC, PE-Texas Red 通道

 

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熒光顯微鏡
Ex:	FITC濾波片組（活），TRITC濾波片組（死）
Em：	FITC濾波片組（活），TRITC濾波片組（死）
推薦孔板:	黑色透明底板

 

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熒光酶標(biāo)儀
Ex:	490 nm (活), 540 nm (死)
Em：	525 nm (活), 620 nm (死)
Cutoff：	515 nm, 590 nm
推薦孔板:	純黑色孔板

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.用測(cè)試化合物制備細(xì)胞
2.加入相同體積的CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）
3.在室溫或37°C孵育1小時(shí)
4.在強(qiáng)度下監(jiān)測(cè)熒光（底部讀取模式）Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）和540 / 620nm（截止= 590nm），帶有FITC濾光片（細(xì)胞存活）的熒光顯微鏡和TRITC濾光片 （細(xì)胞死亡），或FL1和FL2通道的流式細(xì)胞儀。

 

溶液配制

1.儲(chǔ)存溶液配制

        除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
CytoCalcein 綠色原液：
將20μLDMSO（組分C）加入到CytoCalcein Green（組分A）的小瓶中并充分混合以制備CytoCalcein Green原液。 避光。 注意：20μL的CytoCalcein Green原液足以用于一個(gè)平板。 存放時(shí)，密封管。

 

2.工作溶液配制

將全部?jī)?nèi)容物（20μL）的CytoCalcein Green儲(chǔ)備溶液和20μL碘化丙啶（組分B）加入10mL測(cè)定緩沖液（組分C）中并充分混合以制備CytoCalcein Green /碘化丙錠染料 - 工作溶液。 CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液在室溫下穩(wěn)定至少2小時(shí)。 注意：如果CHO細(xì)胞等細(xì)胞含有導(dǎo)致熒光染料隨時(shí)間泄漏的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，應(yīng)制備丙磺舒儲(chǔ)備溶液，并加入到加樣緩沖液中，終孔內(nèi)工作濃度范圍為1到2.5 mM。 未使用的丙磺舒儲(chǔ)備溶液可以在≤-20℃下儲(chǔ)存。 由于佳染色條件可能因細(xì)胞類型的不同而異，因此建議單獨(dú)確定組分A和B的適當(dāng)濃度。有關(guān)細(xì)胞樣品制備的指南，請(qǐng)點(diǎn)擊查看。

 

操作步驟

1.用酶標(biāo)儀或熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定：

1.1根據(jù)需要用測(cè)試化合物處理細(xì)胞。注意：在添加化合物之前不必洗滌細(xì)胞。然而，如果測(cè)試的化合物對(duì)血清敏感，則可在添加化合物之前吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基和血清因子。在抽吸后加入100μL/孔/ 96孔板和25μL/孔/ 384孔板的1X Hank鹽溶液和20mM Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液。或者，細(xì)胞可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

1.2加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的CytoCalcein TM Green / Propidium Iodide染料加工溶液。

1.3將板在室溫或37°C孵育30分鐘至1小時(shí)，避光。 （孵育時(shí)間可以從15分鐘到過(guò)夜。我們得到了佳結(jié)果，孵育時(shí)間少于4小時(shí)）。注意：適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所使用的單個(gè)細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。裝載后請(qǐng)勿清洗細(xì)胞。對(duì)于非粘附細(xì)胞，建議在孵育后以800rpm離心細(xì)胞板2分鐘，然后關(guān)閉制動(dòng)器。

1.4使用熒光酶標(biāo)儀（底部讀取模式）在Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）和Ex / Em = 540 / 620nm（截止= 590nm，細(xì)胞死亡）或熒光下監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度用于活細(xì)胞的FITC過(guò)濾器或用于死細(xì)胞的TRITC過(guò)濾器的顯微鏡。

 

2.使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定：

2.1用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間。

2.1離心細(xì)胞，得到1-5×105個(gè)細(xì)胞/管。

2.3將細(xì)胞重懸于500μL的CytoCalcein?Green / Propidium Iodide染料加工溶液中。

2.4在室溫或37°C孵育10至30分鐘，避光。

可選：用HHBS或您選擇的緩沖液清洗細(xì)胞。 將細(xì)胞重懸于500μLHHBS中，每管加入1-5×105個(gè)細(xì)胞。

2.5用流式細(xì)胞儀在Ex / Em = 490 / 525nm和Ex / Em = 490 / 620nm（FL1和FL2通道）下監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

 

數(shù)據(jù)分析

圖1.使用Cell Meter Cell Viability Assay Kit測(cè)量Jurkat細(xì)胞對(duì)皂苷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響。 用或不用0.5％皂苷處理2×10 6個(gè)細(xì)胞/ mL的Jurkat細(xì)胞5分鐘。 離心細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基替換上清液。 將100uL未處理的細(xì)胞（A），各50μL未處理和處理的細(xì)胞（B），25uL未處理的和75uL處理的細(xì)胞（C）和100uL的0.5％皂苷處理的細(xì)胞（D）接種在 96孔黑色墻壁/透明底部聚-D-賴氨酸板。 將細(xì)胞與100μL/孔的CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料 - 工作溶液在37℃下孵育1小時(shí)。 使用NOVOstar儀器（BMG Labtech）在底部讀取模式下在Ex / Em = 490 / 525nm和540 / 650nm下測(cè)量熒光強(qiáng)度。 如所示（n = 6）顯示活細(xì)胞和死細(xì)胞上490 / 525nm與540 / 650nm熒光強(qiáng)度的比率。

 

參考文獻(xiàn)

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相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)
Live or Dead 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒 *紅/藍(lán)雙色熒光*	Cat#22788