IPTG/X-Gal即用型溶液

產品簡介：

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞閱讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ⁺細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃倒置培養12-16h后，含有插入片段重組質粒的細菌形成白色菌落，而沒有插入片段的質粒細菌形成藍色菌落。

配制方法：

50mg/ml IPTG  5 ml：取250 mg IPTG，溶于5 ml無菌水中，過濾除菌后-20℃貯存。

20mg/ml X-Gal  5 ml：取100 mg X-gal，溶于5 ml 二甲基甲酰胺（DMF），棕色瓶中-20℃貯存。此試劑無需滅菌。

實驗程序：

1、轉化平板的制備：

向鋪好的含有相應抗生素的固體瓊脂平板表面加入16 μl的IPTG(50 mg/ml)、40 μl的X-gal (20 mg/ml)，使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開，盡量使溶解X-gal的二甲基甲酰胺揮發干凈。

2、轉化

（1）取部分連接產物加到50-100 μl感受態細胞中（感受態細胞應剛從-70℃冰箱取出放于冰浴上，待剛剛解凍時加入連接產物，連接產物的加入量不超過感受態細胞體積的十分之一），輕彈混勻，冰浴30分鐘。

（2）將離心管置于精確42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分鐘，其間不

要搖動離心管。

（3）向離心管中加入250-500 μl 37℃預熱的SOC或LB(不含抗生素)培養基，150rpm，37℃振蕩培養45分鐘。此步目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。

（4）將離心管中的菌液混勻，吸取100 μl加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養12-16小時。

3、檢測

將得到的白色菌落接種1-5 ml LB培養基，37℃搖床振蕩培養過夜，保存菌種后提取質粒，應用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。